配对抗体的制备与筛选

配对抗体指的是可以同时结合在一个抗原分子上的两个抗体。配对抗体,一般应用于双抗夹心法ELISA实验。

抗体配对的原理

通常情况下,一个抗原分子拥有多个抗原决定簇,将抗原注射入动物体内进行免疫,针对不同的抗原决定簇会产生不同的抗体。产生的抗体具有特异性与专一性,即一个抗体分子只会特异性地结合一个抗原决定簇。两个针对不同抗原决定簇的抗体,有可能同时结合到抗原分子上。如果两个抗体同时结合到同一个抗原分子上,那么这两个抗体就是配对抗体。

配对抗体的制备与筛选

需要注意的是,即使两个抗体针对的是不同的抗原决定簇,也并不意味着这两个抗体分子一定可以同时与抗原分子结合。当一个抗体与抗原结合后,有可能会导致其他结合位点(抗原决定簇)构型的改变,从而导致其他的抗体无法正常结合到抗原上。位阻效应的存在,也可能使两个结合位点距离较近的抗体无法同时结合在抗原上。因此想要得到可以同时结合在抗原分子上的配对抗体,在制备出抗体后,还需要对得到的抗体进行筛选。这就意味着,要制备配对抗体,要完成以下两步工作:抗体的制备;配对抗体的筛选。

抗体制备

为了便于后续的筛选,制备的抗体应为单克隆抗体,通常利用杂交瘤技术进行单克隆抗体的制备(详细操作流程请见:杂交瘤制备单克隆抗体实验流程)。
注意:如果单克隆抗体很少,很可能会找不到可以配对的抗体,因此,在免疫动物的时候,应多免疫几只动物,以获得更多的单克隆抗体(德泰生物为您提供>10只以上小鼠的免疫,筛选配对抗体)。

配对抗体的筛选

通常,配对抗体筛选的方法是双抗夹心ELISA法。筛选的原理为:在得到了单克隆抗体后,从中取出两种单克隆抗体,一种作为捕获抗体,另一种作为标记抗体(HRP酶标记),将捕获抗体包被在抗原板上,先加入抗原,孵育后洗去未结合的抗原,再加入标记抗体 孵育后洗去未结合的标记抗体,最后加入显色液显色。如果可以显色,说明标记抗体与抗原特异性结合,该捕获抗体与标记抗体为一对配对抗体。如果不能显色,说明标记抗体不能与抗原结合,从而被洗脱,该捕获抗体与标记抗体不是配对抗体。如果选择的两种单克隆抗体不能进行配对,则需重新选择两种单抗,重新进行试验,直至找出可以配对的抗体。

双抗夹心法ELISA筛选配对抗体原理图1:双抗夹心法ELISA筛选配对抗体原理

配对抗体的应用

利用双抗夹心法对目的抗原进行定性定量的检测,必须要用到可以同时与目的抗原结合的配对抗体。对于比较常见的目的抗原,可以通过购买试剂盒的方式得到相应配对抗体。但是市面上试剂盒的种类有限,有些目的蛋白在市面上无法买到对应的试剂盒,为了进行双抗夹心法ELISA实验,需进行相应的配对抗体的生产。

相关服务

抗体配对服务:准备的配对用的抗体≥10株,双抗夹心ELISA实验,OD值≥阳性对照。

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杂交瘤细胞克隆化的常用方法

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆,在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的方法很多,有有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS)分离法。这里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法:

有限稀释法

材料

96孔细胞培养板、HT培养基、活力强的杂交瘤细胞、小鼠腹腔细胞

方法

  1. 制备小鼠腹腔巨噬细胞(饲养细胞);
  2. 制备待克隆的杂交瘤细胞悬液,用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15、50个细胞3种不同的稀释度;
  3. 按照每毫升加入5×104-1×105细胞的比例,在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞;
  4. 进行杂交瘤细胞96孔板分装,每个稀释度32孔,每孔量为0.2ml,每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10;
  5. 37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天,出现肉眼可见的克隆即可检测抗体;在倒置显微镜下观察,标出只有单个克隆生长的阳性孔,再次进行克隆
  6. 重复上述步骤3~5次,直至阳性孔率100%
  7. 进行抗体检测、细胞胞扩大培养并冻存。

说明:本法中(b)(c)(d)等步骤也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确的进行系列稀释,直至每毫升含10个细胞,按每孔接种0.1ml细胞悬液,即每孔含1个细胞。

软琼脂法

材料

HT培养基(双倍浓度)、小鼠腹腔细胞、灭菌平皿、活力很好的杂交瘤细胞、45℃水浴、2%琼脂糖生理盐水(用0.15mol/L NACl配置的2.0%琼脂糖,称取2.0g细胞培养用琼脂糖,悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl,121℃高压灭菌15分钟,分装10ml小瓶,冷却后4℃保存)

方法

  1. 在培养皿中制备单层饲养细胞(小鼠腹腔细胞);
  2. 临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀,配成1%琼脂糖培养液,45%水浴中温育;
  3. 制备杂交瘤细胞悬液:吸取平皿上层培养液,加入1%琼脂糖培养液3ml,室温10 min;
  4. 取杂交瘤细胞悬液1ml,加入1%琼脂糖培养液1ml混匀,铺于培养皿上层;
  5. 37℃、7.5% CO2湿润培养7-14天,克隆生长至2mm时,用毛细吸管吸出克隆,直接转种于含有饲养细胞的24孔板,扩大培养;
  6. 吸取上清,检测抗体,阳性孔可继续克隆化,或扩大培养、冻存。

注意事项

  • 杂交瘤细胞的克隆化需尽早进行,避免其他细胞影响了抗体分泌细胞的生长。
  • 注意无菌操作,一旦发现污染必须及时处理。
  • 做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清。
  • 每次克隆化得到的阳性亚克隆,在继续进行克隆化或扩大培养的同时,应及时冻存几支。

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单克隆抗体制备服务

杂交瘤制备单克隆抗体实验流程

利用杂交瘤制备单克隆抗体通常操作流程为:抗原制备、用抗原免疫动物、取免疫动物的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞、对杂交瘤细胞进行筛选及克隆化、利用筛选得到的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的大量生产。

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抗原制备

用于制备单克隆抗体的抗原纯度越高,单抗制备实验的成功率越高。一般来说,抗原可以是蛋白(天然蛋白或重组蛋白)、多肽、小分子等。

免疫动物

免疫动物的选择

通常,根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠或大鼠作为免疫动物。因为,所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠,所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。就小鼠而言,一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠。

制定免疫方案

免疫方案应根据抗原的特性不同而定,选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。没有一个免疫程序能适用于各种抗原,在设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。现用的免疫程序与多克隆抗体制备的方法类似,免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射等。表1列举了目前常用的免疫程序:

免疫原特性 抗原量 接种次数及间隔时间 抗体滴度 亲和性
免疫源性强(如细胞、细菌或病毒等) 106-107个细胞或1-10ug 2-4次,每次间隔2-4周 中等至强
免疫源性中等 10-100ug 2-4次,每次间隔2-4周 中等或高 中等或强
免疫源性弱 20-400ug 先2-4次免疫,每次间隔一个月;然后2-3次免疫,每次间隔2-3月 中等
10-50ug(2次)
200-400ug(4次)
先2次剂量A,每次间隔1个月;再4次剂量B,每次间隔1天 中等 中等
10-100ug 先2次免疫,每次间隔1个月;再4次免疫,每次间隔10天;然后“休息”1-2个月,最后加强 中等 中等或强

表1:常见的免疫程序

免疫动物

动物的免疫一般在融合前前两个月,根据确定的免疫方案开始对动物进行初次免疫。动物的免疫通常共有三次,在初次免疫2~3周后进行再次免疫,在再次免疫3周后进行加强免疫(如果有需要的话)。一般来说,在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。由不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱,因此在注射抗原的同时,常常会加入佐剂,以增强抗原的抗原性,刺激机体产生较强的免疫反应。

制备杂交瘤细胞

细胞融合前准备

脾淋巴细胞制备
已经免疫的BALB/c小鼠(或LOU/c大鼠),在无菌条件下去除脾脏,并完成脾淋巴细胞的制备。
注意:制备脾淋巴细胞过程中,通常也会进行小鼠眼球摘除采血的的操作,将血清分离后作为抗体检测时阳性对照血清。
骨髓瘤细胞制备
骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系,这样杂交瘤融合效率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAB。骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液,如RPMI1640,DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%~20%,细胞浓度以104~105/ml为宜,最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时,可按1:3~1:10的比例传代。每3~5天传代一次。细胞在传代过程中,部分细胞可能有返祖现象,应定期用8-氮鸟嘌呤处理,使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。
饲养细胞
在组织培养中,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖,若加入其它细胞,则可使这些细胞生长繁殖,这种加入的细胞称为饲养细胞。在细胞融合后选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常必须加入饲养细胞使之繁殖。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。

细胞融合

进行杂交瘤制备的具体操作方法有多种,这里介绍比较常用的一种,读者如果有兴趣可以在网上找其他的操作方法:

  1. 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起,在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次,离心,1200r/min 8分钟,弃去上清,用吸管吸净残留液体(为了避免影响PEG的浓度),轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。
  2. 用吸管在60s内(时间最好控制在45s左右)加预热至40℃的50% PEG(PH 8.0) 1ml,边加边轻轻搅拌。
  3. 用10ml吸管在90s内加20-30ml预热的不完全培养基(终止PEG作用);20-27℃静置10分钟。
  4. 1000r/min 离心6分钟,弃上清
  5. 加入5ml HAT培养基,轻轻吹吸沉淀细胞,使其悬浮并混匀,然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
  6. 分装96孔细胞培养板(孔板内有饲养细胞层),每孔0.1-0.15ml(或分装24孔板,每孔1.0-1.5ml),然后将培养板置37℃,6% CO2培养箱内培养。
  7. 5天后用HAT培养基换出1/2培养基
    1. 7-10天后用HT培养基换出HAT培养基;
    2. 经常观察杂交瘤细胞的生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。

说明:上述步骤中,a~d为PEG介导的细胞融合,e~i为融合后的HAT筛选
融合细胞的筛选
脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后,形成多种细胞的混合体,只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时,由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶,故不能生长繁殖,而杂交瘤细胞具有上述两种酶,在HAT选择培养液可以生长繁殖。

杂交瘤细胞的克隆化

所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化,有时还需进行多次。克隆化的方法很多,如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS)分离法。(相关阅读:杂交瘤细胞亚克隆常用方法

杂交瘤细胞克隆化的意义

从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞,可能来源于二个或多个杂交瘤细胞,因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体,必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面,杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的,有的细胞丢失部分染色体,可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已经不再分泌抗体的细胞,得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系,也需要克隆化。另外,长期液氮冻存的杂交瘤细胞,复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失,因此也应作克隆化,以检测抗体分泌情况。

杂交瘤细胞的冻存

杂交瘤细胞制备单克隆抗体的过程中,通常将一部分杂交瘤细胞冻存起来备用,便于以后大规模生产单克隆抗体以及避免外部不可测的影响因素对实验带来过大的影响。(杂交瘤细胞的冻存与复苏

利用杂交瘤细胞大规模生产单抗

利用杂交瘤细胞大量制备单克隆目前主要有两种方法,一种是动物体内生产法,另外一种是体外培养法。

动物体内生产单抗的方法

鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠(或LOU/c大鼠)的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得,因此使用的动物首选BALB/c小鼠(或LOU/c大鼠)。将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内,在小鼠腹腔内生长杂交瘤,并产生腹水,可得到大量的腹水单抗。该法操作简便、经济且抗体浓度很高。但是,腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括Ig),因此得到的腹水抗体要提纯后才能使用。

体外培养法

体外培养可以采用单层细胞培养的形式,也可以采用悬浮培养的形式。细胞体外培养一定时间后,收集培养上清液,离心去除细胞及其碎片,即可获得所需要的单克隆。抗体相较于免疫动物生产单克隆抗体的方法,体外培养不需要对得到的抗体进行纯化,但该法的产量较低且费用昂贵。

抗体的检测

检测抗体的方法有多种,根据抗体类型的不同,可以选择不同的筛选方法,一般以快速、简便、特异、敏感的方法为优先。其中最常用的为酶联免疫吸附实验(ELISA)法。

ELISA的原理为:将使抗原(或抗体)结合到某种固相载体表面,使抗体(或抗原)与某种酶连接成酶标抗体(或抗原),将待测抗体与酶标抗体(或抗原)按不同的步骤与固相载体表面的抗原(或抗体)起反应。最终结合在固相载体的酶标抗体量与待检测抗体的量呈一定比例。加入酶反应底物,底物被酶催化显色,根据颜色的深浅便进行定性或定量分析。

其它常用的方法有:

  • 放射免疫测定(RIA) 可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
  • 免疫荧光试验 适合于细胞表面抗原的McAb的检测。
  • 其它检测方法如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。

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抗体融合蛋白

抗体融合蛋白(Ig融合蛋白)是指在基因水平上将目的基因同免疫球蛋白部分片段基因相连,并在真核或原核表达系统中表达的重组蛋白。抗体融合蛋白具有抗体的特性及融合功能蛋白的活性,可广泛应用于免疫诊断、免疫治疗、抗体纯化及抗体和抗原的定量分析等,特别可用于免疫导向药物的制备。根据结合的Ig片段的不同,可以将抗体融合蛋白分为Fab融合蛋白、Fc融合蛋白与单链抗体(scFv)融合蛋白。

结构

Fab融合蛋白、单链抗体融合蛋白
研究表明,抗体可变区的N端空间结构上与互补决定区(CDR)形成的抗原结合部位十分接近,有的抗体可变区N端残基甚至直接参与抗原结合部位的形成,如果将效应蛋白与抗体片段的N端结合,可能对抗体可变区的空间构型造成较大影响,从而降低抗体与抗原的结合能力。因此,通常将蛋白与抗体片段的C端进行结合,形成抗体融合蛋白。

Fc融合蛋白

Fc融合蛋白在结构上是将抗体的Fc区与功能蛋白进行融合,可将Fc的N端或C端与目的基因进行融合。根据结合蛋白的不同,可以有多种构型(如下图)。

Fc融合蛋白的结构

图1:Fc融合蛋白的构型

作用原理

含有抗体可变区的抗体融合蛋白
Fab融合蛋白与scFv融合蛋白含有抗体的可变区,可以进行抗原-抗体反应,其作用原理为利用抗体-抗原特异性结合的特性,通过这种特性的引导,将具有生物活性的蛋白靶向引导至细胞的特定部位,进而发挥一定的生物效应,也就是所谓的“生物导弹”。

含可变区的抗体融合蛋白作用原理

图2:Fab/scFv合蛋白作用原理

不含抗体可变区的抗体融合蛋白作用原理

图3:Fc融合蛋白作用原理

不含抗体可变区的抗体融合蛋白
该类融合蛋白含有的抗体功能区为Fc区,不能进行抗原-抗体反应,Fc段的作用为延长药物在血浆内的半衰期、增加融合蛋白的稳定性等。Fc融合蛋白药理作用的发挥依赖于功能蛋白部分,利用受体-配体之间的相互作用产生一系列的生物学效应。

抗体融合蛋白制备

最初抗体融合蛋白制备的方法为化学交联法,但这种方法制备的抗体融合蛋白组成不均一、性能不稳定、免疫源性大,随着基因工程技术的发展,该技术已被淘汰。目前主要利用基因工程技术来进行抗体融合蛋白的制备。其制备原理为:将抗体基因与目的蛋白基因通过一段接头序列(linker)进行链接,然后将链接产物亚克隆至载体中,并用原核或者真核表达系统进行表达。

制备抗体融合蛋白过程中,一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )的长度,linker的长短对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短,可能影响两蛋白高级-结构的折叠,从而相互干扰;如果接头序列太长,又涉及免疫原性的问题。

抗体融合蛋白与双特异性抗体

抗体融合蛋白是将抗体的部分片段与目的蛋白进行融合表达得到的重组蛋白,若将两个具有不同抗原特异性的抗体片段连接至同一蛋白,即可得到双特异性抗体

单克隆抗体与抗体融合蛋白区别

单克隆抗体 抗体融合蛋白
结构 Y型 具有多种结构
制备方法 杂交瘤技术/基因重组 基因重组
表达系统 真核系统/原核系统 真核系统/原核系统
作用原理 特异性识别抗原,Fc段引起ADCC、ADCP、CDC等作用。 功能蛋白与靶分子间的受体-配体的相互作用。

表1:单克隆抗体与抗体融合蛋白比较

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双特异性抗体种类及其特点

双特异性抗体按结构区分主要有两大类:含FC区的双特异性抗体(IgG-like双特异性抗体)与不含Fc区的双特异性抗体(non-IgG-like双特异性抗体)。

含Fc区双特异性抗体

IgG-like双特异性抗体结构与普通的单克隆抗体类似,呈”Y”型结构。具有较好的稳定性,较高的亲和力,在体内的半衰期比较长。

Triomabs双特异性抗体

Triomabs双特异性抗体(Trifunctional Antibodies) 是将 CD3 特异性大鼠源 IgG2b 抗体和肿瘤靶向小鼠源 IgG2a 抗体进行体细胞杂交获得的双特异性抗体。Triomabs 通过 Fv 功能区分别结合肿瘤细胞及 T 细胞,通过 Fc 功能区募集表达 FcR的功能细胞,如 NK 细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞及树突状细胞等,形成复合体,刺激 T 细胞分泌细胞因子清除肿瘤细胞 因此 Triomabs 又被称为三功能抗体。

TandAb双特异性抗体结构与作用原理图解

图1:Triomabs双特异性抗体结构及作用原理

杵臼结构( knob-in-hole,kih IgG) 双特异性抗体

杵臼结构抗体是利用 knob-in-hole技术制备的双特异性抗体。其结构特点为:组成双特异性抗体的两对轻重链对,其中一对的重链的CH3区发生突变形成一个突起的“杵”的结构,另一对的重链的CH3区发生突变形成一个凹陷的“臼”的结构,杵臼结构设计有利于两种种异源抗体重链的正确装配。

单克隆抗体、三功能抗体与knob-in-hole抗体的结构图

图2: 单克隆抗体、三功能抗体、knob-in-hole抗体结构

CrossMAb双特异性抗体

CrossMAb双特异性抗体是利用CrossMAb技术,将双特异性抗体的其中一条Fab抗体臂的功能区进行互换得到的双特异性抗体。

常见的CrossMab结构说明图

图3:常见的CrossMab双特异性抗体结构

CrossMAB是一种抗体Fab抗体臂的功能区互换的技术,是由罗氏开发的技术平台。该技术在“knob-in-hole”技术的基础上通过Fab臂功能区互换,解决了同源轻重链正确装配的问题,进一步提高了装配的成功率。

DVD-Ig双特异性抗体

在正常抗体轻、重链的N 末端分别再接入另一个抗体的VL 和VH,形成双特异性抗体。

Two-in-one 双特异性抗体

又称作DAF 抗体(Dual Action Fab),是普通抗体经过噬菌体展示技术改造得到的抗体,其结构特点为每一个抗原结合臂都有两种抗原的结合靶点。

DVD-Ig双特异性抗体结构与2 in 1-IgG双特异性抗体结构图

图4:DVD-Ig与2 in 1-IgG结构图

不含Fc区的双特异性抗体

这种构型的双特异性抗体缺失了Fc区,由两个抗体的VH区及VL区组成或者由Fab片段组成。此类双特异性抗体主要有 BiTE,DART,TandAbs,bi-Nanobody 等。

BITE

BiTE 是将抗 CD3 单链抗体( scFv) 与不同抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体(scFv)通过肽段进行连接而获得,可同时结合 CD3 阳性 T 细胞及肿瘤细胞并诱导T细胞靶向杀伤肿瘤细胞。

BITE结构与作用原理说明图

图5:BITE结构与作用原理

BiTE的分子量为55-60KDa,属于小分子,渗透性好,可以到达大分子抗体难以到达的部位与抗原发生结合。但亲和力较低,在体内的半衰期较短。

DART双特异性抗体

DART 双特异性抗体是由两条多肽链结合形成的异源二聚体抗体,其结构是将一个抗体可变区的 VH 和 VL 序列分别与另一个抗体可变区的 VL 和 VH 序列连接形成。此外,在两条多肽链的 C 末端引入了半胱氨酸,通过半胱氨酸形成链间二硫键,提高产品的稳定性。

DART双特异性抗体结构说明图

图6:DART双特异性抗体结构

DART的作用主要有三方面:与靶向配体结合,实现细胞因子阻断;与靶细胞结合,实现抑制或阻断细胞激活信号;招募效应细胞杀伤靶细胞。

DART的作用机制说明图

图 7:DART作用机制

TandAbs 双特异性抗体

双特异性抗体是四价的抗体分子,结构为 Fv1-Fv2-Fv2-Fv1,是由两分子肽链反向配对形成的同源二聚体分子。TandAbs 相对分子质量约为 110 kD,介聚体分子于全分子抗体及 BiTE之间。TandAbs可以同两种抗原结合,并且每种抗原都有两个结合位点。

TandAbs 可以招募效应细胞(T细胞或NK细胞),并对靶细胞(肿瘤细胞或癌细胞)起到杀伤效果。当TandAbs连接了T细胞与肿瘤细胞后,T细胞会被激活,释放穿孔素、颗粒酶、溶酶体酶等物质,这些物质会被传送到T细胞的细胞膜并分泌到细胞外的基质中。穿孔素会使靶细胞内形成气孔,从而促进裂解物质的进入,进而引起靶细胞的裂解。

TandAB双特异性抗体结构及作用原理

图8:TandAbs结构与作用原理

双特异性抗体特点

含Fc区的双特异性抗体:溶解性和稳定性好; 具有较长的半衰期;ADCC和CDC效应,增强肿瘤杀伤效果。
不含Fc区的双特异性抗体:体型较小; 改良后大幅降低使用的剂量,约为普通抗体的1/100以下。
引用:郭婷婷,梁锦峰.双特异性抗体药物的研究进展[J].中国新药杂志,2016,25(5):521-522.

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双特异性抗体作用原理与制备方法综述

抗体亲和力测定

抗体与抗原表位或抗原决定簇之间的结合力称为抗体亲和力,其本质是一种非共价作用力,包括对氨基酸之间的吸引力,氢键,疏水性作用力等。抗体亲和力体现了一个抗体分子和一个半抗原分子或抗原分子的一个决定簇起反应的能力。
抗体亲和力的大小可以用亲和力常数KD(单位为升/质量摩尔浓度)表示,其计算公式为

KD=[Ab▪H]/([Ab][H])

其中[ ]表示摩尔浓度,Ab表示抗体,H表示半抗原,Ab—H表示抗体与半抗原的结合物
亲和力常数KD越低,则抗体结合半抗原的能力越强。抗体亲和力的强弱取决于抗体对位(Paratope)与所用抗原表位(epitope)之间的配合程度,包括接触面积的大小、吻合的密切程度、以及带点基团与疏水基团的分布等。
亲和力高低影响因素图解

图1:亲和力高低影响因素图解

抗体亲和力测定方法

生物膜干涉技术(BLI)

根据生物膜干涉技术(BLI),可利用Fortebio Octet®检测仪器对抗体亲和力进行测定的原理为:生物传感器底端由固定的相互作用分子组成的生物膜层覆盖,当具有一定带宽的可见光垂直入射生物膜层时,光在生物膜层的两个界面反射后形成被光谱仪检测到的一定波长的干涉波。固定分子与溶液中分子发生相互作用时,生物层厚度增加,干涉光谱曲线向波长增加的方向移动,相位移动由工作站探测并分析,可定量得出传感器表面分子数量变化及相关浓度与动力学数据。
Fortebio Octet®实验原理

图2:Fortebio Octet®实验原理

德泰生物提供Fortebio Octet®抗体亲和力测定服务,结果准确可靠,欢迎咨询!

固相放射免疫法(SP-RIA)

固相放射免疫法可以比较准确的测出抗体亲和力常数,其操作步骤为:用抗原(如病毒颗粒或蛋白质)包被微板,加入系列稀释的定量单克隆抗体。温育至反应平衡后,洗去未结合的单克隆抗体加放射性同位素标记的抗小鼠lg第二抗体,温育后洗涤,将小孔割下计数结合的放射性强度。只要保持包被抗原量恒定,即可按公式([Ab]a/[Ab]r-[Ab]B)/(Ab)a=-nK。其中[Ab]a为结合抗体浓度,[Ab]r为总抗体浓度,n为抗体结合价,K为亲和力常数。

平衡透析法

利用平衡透析法进行抗体亲和力的测定需要两个前提:配体(半抗原分子)要为小分子且可以穿过半透膜;配体分子可以以某种方式标记(例如同位素3H)

平衡透析法测抗体亲和力图解

图3:平衡透析法测抗体亲和力图解

将放射性标记的配体溶于缓冲液置于中间由半透膜隔开的透析室的一侧(F室),将非特异性抗体置于透析室的另外一侧(B室)。随着时间的推移,配体会透过半透膜从F室到达B室,配体与非特异性抗体不发生结合,则各室的配体浓度随时间变化如右图所示。

平衡透析法测抗体亲和力图解

图4:平衡透析法测抗体亲和力图解

将放射性标记的配体溶于缓冲液置于中间由半透膜隔开的透析室的一侧(F室),将非特异性抗体置于透析室的另外一侧(B室)。随着时间的推移,配体会透过半透膜从F室到达B室,在B室中配体与特异性抗体结合,各室的配体浓度随时间变化如右图所示。

当抗原-抗体结合反应Ab+H⇌Ab▪H达到平衡时,利用方程式1/[b]=1/k×1/[Ab]×1/[H]+1/[Ab]即可计算得到亲和力常数K(其中[b]为结合配体的质量摩尔浓度,[H]为游离配体的质量摩尔浓度,[Ab]为抗体结合位点浓度,由抗体质量摩尔浓度×抗体结合价得到)。

对于无法穿过半透膜的大分子抗原,可以利用能穿过半透膜的Fab抗体片段来进行抗体亲和力的测定实验。

结合抗原沉淀法

将单价抗原与相应抗体同在溶液中温育进行抗原-抗体反应。在反应达到平衡后,用50%饱和硫氨酸或15%聚乙二醇进行沉淀,将结合与游离抗原分离,分别测定浓度,继而按照上述公式计算出亲和力常数K。

放射免疫法(RIA)

将系列稀释的定量单克隆抗体与痕量的放射标记抗原分子在溶液中一同温育(单克隆抗体必须大大过量),平衡后测定结合曲线。根据米-曼氏动力学原理,50%最大结合处单克隆抗体结合价浓度的倒数即为亲和常数K。

酶联免疫吸附实验(ELISA法)

ELISA的灵敏度很高,利用ELISA可以测出10-8M数量级的亲和力常数,可以满足一般抗体亲和力的测定需要。且ELISA无需对抗原或抗体进行标记,操作简便易行,是目前常用的亲和力测定方法。其操作方法为:将抗体与定量的抗原一同在溶液中温育,进行抗原-抗体反应。当反应达到平衡后,将溶液移至包被有相同固相抗原的聚苯乙烯微板中,用常规间接法ELISA测定溶液中剩余的游离抗体量。利用测出的OD值直接计算出亲和常数。当所用抗原≥所用抗体量10倍时,计算中可对抗体量忽略不计,这时可以用公式A0/(A0-A)=1+Kd/a计算出亲和力。其中A0为无抗原存在时抗体的OD值,A为加入了质量摩尔浓度为a的抗原后的OD值,Kd为抗体亲和力常数的倒数。竞争ELISA法测定抗体亲和力

表面等离子共振法(SPR)

SPR测定抗体亲和力是基于表面等离子共振技术建立的一种亲和力测定技术。只需按照仪器说明对进行操作,在加好样品后,便可以得到亲和力常数。相较于竞争ELISA法,SPR法测定抗体亲和力有诸多优势,如可以实时监测反应的动态过程,实验结果重现性好、仪器记录的数据不能随意更改,减少了主观因素的影响、实验的重复性更好等。表面等离子共振法测定抗体亲和力

抗体亲和力测定的意义

在重组抗体被生产出来之后,必须对其进行亲和力测定以保证可以顺利的应用于下游应用。在RIA、ELISA、免疫荧光检测(IFA)等免疫学实验中,抗体对特异性待测抗原的亲和力必须高于一定的阈值,才能保证测定的灵敏度和可靠性。用抗体偶联于固相进行亲和纯化抗原时,为避免强烈的洗脱条件造成抗原变性,需中等亲和力的抗体,以便能用较温和的条件进行洗脱。由于一般抗血清抗体是亲和力相差很大的多克隆抗体混合物,用于上述不同目的时,其中相应亲和力的组分将能发挥预期的作用。而用单克隆抗体取代多克隆抗体血清时,就必须对其亲和力进行测定,才能选出合适的备用者。另外,由于某些单克隆抗体对某一抗原的特异性亲和力随环境条件(如温度、PH、离子成分与强度等)的改变(甚至很微小的变化),会有很大的差别,故为某一目的而选择单克隆抗体时,应采取与实际应用时条件相仿的方法测定其亲和力。

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抗体亲和力成熟

相关服务

重组抗体制备服务
金建平,《生物工程学报》,1987,3 (3):110-113

噬菌粒和辅助噬菌体

噬菌粒结构

噬菌粒是一种对丝状噬菌体进行人工改造得到特殊类型的载体,兼具了丝状噬菌体与质粒的优点,由单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因等部分组成。噬菌粒具有基因组较小可插入较大片段、复制型为双链DNA易于操作、转化效率高、产生的重组子更加稳定等优点。
噬菌粒结构

图1:噬菌粒结构

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噬菌粒的原件及其特点

衣壳蛋白

丝状噬菌体有PⅧ,pⅢ、pⅥ、PⅦ和PⅨ五种衣壳蛋白,这五种蛋白都可以用来进行多肽的展示,但最常用的是pⅢ和pⅧ蛋白。

启动子

启动子是表达载体的核心元件,噬菌粒载体最常用的启动子有乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子和T7启动子。

信号肽

噬菌粒载体信号肽通常选择Sec-识别信号或SRP-识别信号肽。研究表明,Sec-识别信号肽适合展示分泌蛋白,如抗体;SRP-识别信号肽适合转运折叠比较迅速的蛋白,如锚定蛋白。

基因间隔区(IG region)

基因间隔是DNA的一个片段,不属于编码区。在噬菌粒进入宿主细胞质后,IG区的单链DNA复制起始位点(噬菌体ori区域)会被PⅡ蛋白识别进而引发单链DNA的生成。

噬菌粒生命周期

噬菌粒作为一种特殊的质粒,可以像一般的质粒那样被复制,也可以在病毒体内作为单链DNA被包装。

噬菌粒的生命周期通常为:将外源基因以双链形式定向整合至噬菌粒,然后通过化学转化或电转等方式转入宿主细胞。由于噬菌粒中除了PⅢ蛋白基因以及欲在噬菌体上展示的外源基因外,没有任何噬菌体功能基因,导致噬菌粒不能独立合成单链DNA,因此,需要在辅助噬菌体的帮助下才可以完成对宿主细胞的侵染。

在没有辅助噬菌体超染时,噬菌粒像质粒一样进行扩增;宿主经辅助噬菌体超感染后,在辅助噬菌体的作用下,噬菌粒IG区的正链复制起始位点产生ssDNA,随后噬菌粒的ssDNA与pⅠ、pⅣ、pⅪ和宿主细胞的硫氧还原蛋白完成复杂的组装过程,含有噬菌粒基因组的噬菌体成熟。成熟的噬菌体由细胞质释放到外部环境中。至此噬菌粒的生命周期完成。

辅助噬菌体

辅助噬菌体是一种自身DNA复制效率极低的丝状噬菌体突变型。其基因组具有M13噬菌体的所有功能基因,但IG区是缺陷的,不能被pⅡ蛋白识别,因而辅助噬菌体本身DNA不能进行单链复制。辅助噬菌体能为噬菌粒提供pⅡ蛋白和包装蛋白,在辅助噬菌体的帮助下,噬菌粒可以顺利的进行DNA的复制与噬菌体的包装,完成对宿主的侵染(这一过程通常称为超染)。常用的辅助噬菌体有VCSM13和M13K07等。

辅助噬菌体的工作原理为:当含有重组基因的噬菌粒转染至大肠杆菌后,再用辅助噬菌体进行超染,辅助噬菌体合成的pⅡ蛋白就会优先识别噬菌粒上的正常基因间隔区(IG region),启动滚环复制,产生ssDNA,这样所产生的子代噬菌体外壳蛋白所包装的ssDNA主要是来自含有重组基因组的噬菌粒的DNA,并同时展示噬菌粒编码的pⅢ或pⅧ与外源肽段的融合蛋白和辅助噬菌体编码的野生型pⅢ或pⅧ蛋白,确保重组噬菌体能正常感染组装和增值。
辅助噬菌体工作原理

图2:辅助噬菌体原理解析

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利用噬菌体展示制备抗体流程

抗体片段Fab

什么是Fab?

Fab片段(Fragment of antigen binding)也叫做抗原结合片段,是抗体结构中可以与抗原结合的区域。Fab片段由一条完整的轻链与重链的VH和CH1结构域(Fd段)组成,分子量约5×104。轻链与重链均存在一个恒定区与一个可变区,轻重链间存在二硫键链接。
目前,Fab抗体片段可以在实验室制备出来。在木瓜蛋白酶的作用下,人免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段(fragment crystallized, 结晶片段);在胃蛋白酶的额作用下,IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc’片段。F(ab’)2片段可以进一步被还原,形成两个Fab’片段。

Fab 抗体结构

酶解法制备Fab、Fab’以及F(ab’)2

Fab片段制备

目前有酶解法、利用表达系统制备以及利用噬菌体展示技术进行抗体库筛选等方法进行Fab片段的制备。酶解法通常用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等酶对人免疫球蛋白G进行降解,得到F(ab’)2,Fab,Fc片段等产物;利用表达系统生产Fab片段,通常利用大肠杆菌表达系统与哺乳动物表达系统。大肠杆菌表达系统具有生产成本低、生产速度快等优点,但容易形成包涵体,复性后活性难保证,有可能会影响实验研究。用哺乳动物系统表达Fab抗体片段,可以顺利的形成二硫键,更接近天然Fab结构,活性也更高,可以更好的应用于下游科研研究,是优于大肠杆菌表达系统的选择。利用噬菌体展示技术,先制备Fab片段抗体库,在经过数轮的筛选富集,即可得到高亲和性的Fab抗体。

Fab抗体片段的纯化

对IgG进行酶解后,可以得到Fab片段与Fc片段的混合物。可用protein A对混合物进行纯化,蛋白A可以和混合物中的Fc段特异性结合,最终被洗脱,从而达到纯化的目的。

在表达系统表达出Fab片段后,可以在分子的C端加6个His标签,用亲和层析技术对表达后的产物进行纯化。

Fab片段的发展与应用

和单抗的发展历程一样,Fab的发展经历了鼠源性(murine)、嵌合性(chimeric)、人源化(humanized)和全人源单抗性(human monoclonal antibody)四个阶段。嵌合Fab片段是由鼠源可变区和人源恒定区组成,人源化Fab片段是由鼠源CDR和人源框架区组成。

与完整的IgG相比,Fab片段缺少Fc段,虽然能与抗原选择性结合但不会发生沉淀反应;由于自身免疫原性低,不能被活体的免疫细胞识别,因此能显著降低超敏性反应发生的概率,提高产品的安全性。Fab类抗体片段具有分子质量小、组织分布特异性强、免疫原型低、可基因工程操作等特点,使Fab成为了医药研究领域的重要成员之一,Fab类药物在预防、诊断、治疗等领域有着广泛的应用。

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单链抗体scFv简介

噬菌体展示

噬菌体展示技术(phage display technology)的本质是一种筛选技术。将不同的外源基因分别插入噬菌体载体中,随着噬菌体的传代,外源蛋白会展现在噬菌体表面,形成噬菌体文库。随后用特定蛋白对噬菌体文库进行筛选,便可快速的得到与该蛋白具有高度亲和力的抗体。筛选出的抗体可以进一步用于生物学功能研究。

噬菌体展示技术原理

噬菌体展示技术的原理,是将一段外源基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下,外源基因会随着外壳蛋白的表达而表达,从而使多肽或蛋白以融合蛋白的形式展现在噬菌体表面。
噬菌体展示原理

图1.噬菌体展示原理

被展示的蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性,有利于靶蛋白的结合,因而可以利用靶蛋白快速的进行噬菌体展示抗体库的筛选。在展示文库构建完成后,以靶蛋白为固定相,和展示文库共同孵育一段时间,洗去未结合噬菌体,再以竞争受体洗脱吸附的噬菌体。洗脱得到的噬菌体感染宿主菌繁殖扩增,然后进行下一轮洗脱。经过3~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后(对于某些亲和力弱的抗体需经过更多轮的洗脱),便可以得到能与靶蛋白特异性结合的噬菌体的高度富集。
噬菌体文库淘选流程

图2. 生物淘洗法筛选噬菌体展示文库

筛选得到的高度亲和力的噬菌体集合中可能含有多个克隆,可以利用ELISA或Westen Blot进一步对得到的外源蛋白进行筛选,或对蛋白进行铺盘分离单克隆菌株,从而得到特异性的单克隆抗体,进而进行生物学方面研究。

噬菌体展示技术与其他抗体制备方法对比

免疫血清 杂交瘤技术 噬菌体展示技术
抗体形式 多克隆抗体 单克隆抗体 单克隆基因重组抗体
宿主细胞 N/A 杂交瘤 细菌
筛选范围 N/A ~103 107-109(免疫库)
操作 简单 复杂 相对简单
免疫 必须 必须 可避免
时间 数月 数月 几周
人源化抗体
生产量 有限 有限 无限
基因获取 N/A 再克隆 直接获取
应用前景 有限 有限 广阔

表1.不同抗体制备方法比较

噬菌体展示系统

单链丝状噬菌体(M13)展示系统

丝状噬菌体是一种能够感染阴性细菌的病毒大家族。他们都含有单链DNA基因组,其衣壳蛋白为管状,通常由几千个拷贝的主要衣壳蛋白(PⅧ)和位于尾端的次要衣壳蛋白(PⅢ)组成。
si-zhuang-shi-jun-ti-jie-gou

图3. 丝状噬菌体结构

PⅢ展示系统:PⅢ是丝状噬菌体的次要外壳蛋白,位于病毒颗粒的尾端,是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个~5个拷贝PⅢ蛋白,其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域,这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中N1作用于E.coli细胞膜上的TolA蛋白,与噬菌体入侵有关;N2为受体结合区,负责结合F菌毛;CT疏水区在组装前粘附在细菌内膜上,与噬菌体组装中止有关。PⅢ有2个位点可供外源序列插入,当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时,该系统保留了完整的PⅢ蛋白,噬菌体仍有感染性;但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连,则噬菌体丧失感染性,这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解,所以有辅助噬菌体超感染时,可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白,即所谓“单价”噬菌体。
PⅢ蛋白结构域

图2. PⅢ蛋白结构域及其功能

PⅧ展示系统:PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白,位于噬菌体外侧,C端与DNA结合,N端伸出噬菌体外,每个病毒颗粒有2 700个左右PⅧ拷贝。PⅧ的N端附近可融合五肽,但不能融合更长的肽链,因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍,影响噬菌体装配,使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时,可提供野生型PⅧ蛋白,降低价数,此时可融合多肽甚至抗体片段。

PⅢ PⅧ
拷贝数
展示蛋白 单价展示 多价展示
多肽片断大小 <10个氨基酸
亲和力
适用范围 常用于展示有cDNA和基因组序列编码的多肽,范围较广 展示小肽,范围较窄

表2. PⅢ展示系统与PⅧ展示系统比较

λ噬菌体展示系统

PV展示系统:λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分,该管状结构由32个盘状结构组成,每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域,C端的折叠结构域(非功能区)可供外源序列插入或替换。λ噬菌体的装配在细胞内进行,故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体,这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。

D蛋白展示系统:D蛋白的分子质量为11 ku,参与野生型λ噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明,D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,可以在缺少D蛋白的情况下完成组装,故D蛋白可作为外源序列融合的载体,而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外,体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面,而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中,从而补偿溶源菌所缺的D蛋白,通过热诱导而组装。该系统有一个很好的特点,噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制,这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。

T4噬菌体展示系统

T4噬菌体展示系统的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质,分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC(9 ku)和HOC(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌体的表面,因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化,避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配,不需通过分泌途径,因而可展示各种大小的多肽或蛋白质,很少受到限制。同时,SOC与HOC蛋白的存在与否,并不影响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳的表面,事实上,在DNA包装被抑制时,T4是双股DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体(SOC和HOC也同时组装)。因此,在用重组T4做疫苗时,它能在空衣壳表面展示目的抗原,这种缺乏DNA的空衣壳苗,在生物安全性方面具有十分光明的前景。

T7噬菌体展示系统

T7噬菌体是20世纪90年代末期建立的一种新型噬菌体展示技术。T7噬菌体是一种含有双链丝状DNA的烈性噬菌体,其衣壳蛋白一般又10A和10B两种形式。外源基因插入的位置一般位于10B蛋白的C端,这样好处有两点,一方面C端结合空间位阻小;另外一方面,C端的蛋白较晚被翻译,即使是外源蛋白质的编码基因中含有终止密码子,也不影响与其N端融合的10B蛋白的完整表达。与M13系统相比,T7噬菌体直接使宿主菌进行裂解,因而不需经过分泌过程。因此,对于那些对分泌过程有抑制作用的蛋白和多肽,在M13系统不能很好的展示,但是可以在T7系统中展示。除此之外,T7噬菌体优势有:

  • 生产非常迅速,在固体培养基上形成噬菌体只需3h,在菌液中从感染到裂解只需1~2h,可以节省大量的时间;
  • 对于>50个氨基酸的多肽,T7噬菌体可以在不需要辅助噬菌体的情况下进行包装。
  • 可高拷贝数展示约50个氨基酸的多肽片段(450/噬菌体),可中拷贝数展示900~1200个多肽片段(5~15/噬菌体),可低拷贝数展示900~1200个氨基酸的多肽片段(0.1~1/噬菌体)
  • T7噬菌体在高PH值、高盐、变性剂(100 mmol/L DTT)等条件下十分稳定,可根据不同需要采用多种条件进行筛选,并能在筛选后仍然保持很高的筛选活性。

噬菌体展示应用

噬菌体展示技术拥有诸多优势,它实现了蛋白/多肽基因型与表型的统一,在蛋白质与其遗传基因之间建立了直接的物理联系;可以快速的筛选得到所需抗体;通过这项技术不仅可以筛选到一般抗原的特异性抗体,也可以产生非免疫原性或毒性抗原的抗体,能够产生具有识别功能的人抗体,如scFv、Fab、双功能抗体,及三价四价抗体等。所得到的抗体可以是Fab、scFv,也可以进行抗体工程改造,转变成其他形式的小分子抗体、免疫毒素、靶向细胞因子或全抗体等,应用广泛;相较于免疫动物生产单克隆抗体,利用噬菌体展示技术生产单克隆抗体,生产快速,操作简便,效率更高,且可以进行人源化抗体的生产,具有更高的利用价值。

经过多年的研究与发展,噬菌体展示技术已成为一门综合了多个学科理论、方法及策略的前沿技术,在免疫学、分子生物学、基因功能组学和新药研究等领域发挥着不可替代的作用。下面列出了各个噬菌体展示系统的一些应用案例:

噬菌体展示系统 应用案例
M13噬菌体展示系统 PⅢ蛋白:N端展示蛋白酶抑制剂、神经末梢集合多肽、抗白色念球菌短肽,抗体特异性Notch受体蛋白、识别MBP的sAHs等,C端展示研究蛋白相互作用。
PⅧ蛋白:C端展示研究分子间相互作用
λ噬菌体展示系统 D蛋白:C端构建全基因组展示文库研究新型肺炎支原抗体、抗原、研究蛋白质相互作用。
T4噬菌体展示系统 SOC蛋白:C端和N端高拷贝展示碳疽热毒素。
HOC蛋白:碳端和N端展示HIV病毒p24蛋白。
在HOC的N端和SOC的C端双位点展示猪瘟疫苗、随机肽库分析gp17和gp55相互作用
T7噬菌体展示系统 10B蛋白:C端构建随机肽展示文库、ORFs cDNA展示文库及筛选磷脂酰丝氨酸结合蛋白

表3. 各个噬菌体展示系统的应用案例

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噬菌粒及辅助噬菌体介绍

噬菌体展示文库的构建与筛选

噬菌体展示技术是一种用于识别蛋白质和其他大分子配体的体外筛选技术。由Simth于1985年建立。其原理是将外源多肽或蛋白质的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白的一个结构基因的适当位置上,在阅读框正常且不影响外壳蛋白正常功能的情况下,使外源基因随着外壳蛋白的表达而表达,最终多肽或蛋白以与外壳蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。被展示的蛋白或者多肽可以保持相对的空间结构和生物活性,可以利用靶蛋白对其进行筛选。

高亲和力抗体筛选

噬菌体抗体库构建

利用噬菌体展示技术进行高亲和力抗体的筛选,需要先构建抗体库,然后再对噬菌体文库进行筛选。将外源基因插入噬菌体基因适当位置,随着噬菌体的传代,外源蛋白展现在子代噬菌体的表面。所有展示不同外源基因的噬菌体的集合,即噬菌体展示文库。

用于构建文库的不同序列的核酸片段有人工合成法、cDNA法、DNase I随机水解DNA等方法获得。用于构建文库的噬菌体展示系统有单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统及T7噬菌体展示系统等。
利用cDNA法获得基因片段并进行噬菌体展示文库构建的操作流程为提取mRNA ;逆转录得到cDNA ;设计合适引物,以cDNA为模板,PCR得到基因序列;将基因克隆至噬菌体载体中;电转感受态细胞,辅助噬菌体超染;收集上清,上清即为噬菌体展示文库。

噬菌体展示文库构建流程

图1:噬菌体展示文库构建流程

噬菌体抗体库的筛选

筛选的方法主要分为体内筛选和体外筛选两种。体内筛选是指将噬菌体展示文库静脉注射到动物体内,因为血管分子内皮的异质性,噬菌体可以有选择性的导向不同组织,这样就可以得到与不同组织特异结合的噬菌体展示抗体;体外筛选的方法有生物淘洗法、竞争法、消减法、选择性感染筛选、延迟性感染筛选等方法。其中生物淘洗法最为常用。本文主要对生物淘洗法筛选噬菌体抗体库进行说明。

生物淘洗法:以靶蛋白为固定相,以噬菌体展示文库为流动相,经过一段时间的共同孵育后,洗去未结合的游离噬菌体,然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体,洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增,进行下一轮洗脱,经过3轮~5轮的“吸附-洗脱-扩增”后,即可得到与靶蛋白具有高亲和性的抗体。

噬菌体展示技术筛选流程

图2:噬菌体展示技术筛选流程

经过筛选后,对筛选得到的蛋白进一步用酶联免疫吸附测定或免疫印迹法对其进行特异性筛选,获取目的克隆或铺盘进行单克隆分离继而进行大规模生产。

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